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物理方法提高高溫變性豆粕可溶性蛋白質的方法


摘要:研究了微波處理、水浴加熱、聲處理及高壓均質對高溫變性豆粕可溶性蛋白含量的影響。 通過實驗證明微波處理和水浴加熱對提高高溫變性豆粕氮溶解指數效果明顯,並對兩種加熱處理方式進行了正交 L9( 34) 優化試驗。 結果表明,微波( 700 W) 處理在 pH 8. 0,底物質量分數3% ,時間 5 min 時氮溶解指數達到 70. 39% ; 加熱處理高溫變性豆粕的較佳條件為 pH 8. 0,反應時間 90 min,底物質量分數為 1 %,其溶液氮溶解指數可達 74. 81%; 但在較高底物質量分數( 3%)下,加熱處理高溫變性豆粕的氮溶解指數隻達到 63. 96%。 微波處理後蛋白質的其他功能性要優於酶處理後的,因此微波加熱處理高溫變性豆粕可有效提高生產效率,有利於實現工業化生產。


大豆蛋白是一種優質的植物蛋白質資源,具有良好的功能特性。 功能特性的體現要依賴於蛋白質的溶解性,所以,蛋白質的溶解性將影響蛋白質的功能特性。 高溫變性豆粕是大豆製油後的副產物,製油工藝中高溫處理工序造成了蛋白質的熱變性,導致了高溫變性豆粕的蛋白質溶解度較低。 可采用物理、化學、生物方法等的處理方式,以提高蛋白質的溶解性和功能特性,其中物理改性由於較為簡單安全,因此被廣泛應用。 Jambrak 等利用聲波對大豆蛋白和乳清蛋白進行處理,塗宗財等、Iordache 等對大豆分離蛋白和熱變性乳清蛋白進行了高壓均質及高壓射頻均質處理,結果表明蛋白質的溶解性均有明顯提高,並且處理後的蛋白質發泡性、乳化性和凝膠性效果均得到了改善。


Arrese 等、Petruccelli 等和 Wagner 等在 20世紀 90 年代對大豆分離蛋白進行了不同程度的熱處理,熱處理後的大豆分離蛋白仍然具有較高的溶解性。 近些年隨著微波加熱技術的發展,利用微波技術輔助加工食品原料成為研究重點。 Tao Yong-zhen 等利用微波加熱技術處理多糖類物質,使其溶解性大大提高。 但這些技術應用於高溫變性脫脂豆粕的文獻國內未報道,本研究擬利用聲波、高壓均質、水浴加熱和微波加熱處理方式對高溫變性豆粕進行處理,以期提高高溫變性豆粕的溶解性。



1 材料與方法


1. 1 實驗材料


高溫變性豆粕,黑龍江省雙鴨山市楊霖油脂廠。


1. 2 實驗儀器及試劑


THZ -82 型恒溫水浴振蕩器,金壇市億通電子儀器有限公司;


恒溫水浴鍋,餘姚市東方電工儀器廠;


KQ-500B 型容器式聲波儀,昆山市聲儀器有限公司;


MM-2270M 型微波爐,青島海爾公司;


JJ -0. 1 /60 型均質機,廊坊市通用機械有限公司;


飛鴿TDL -40B 型離心機,上海安亭科學儀器廠;


PHS -3C型酸度計,上海雷磁儀器廠;


HYP -2 型消化爐,上海纖檢儀器有限公司;


TDW 馬弗爐: 溫州市雙嶼儀器廠。


化學試劑為化學純或分析純; 消泡劑為食品級。


1. 3 實驗方法


1. 3. 1 測定方法


蛋白溶解度測定: 蛋白溶解度 = 上清液蛋白質含量/樣品總蛋白含量;


蛋白質含量測定參考 GB 5009. 5—2003;


粗脂肪測定參考 GB 5009. 6—2003;


灰分測定參考 GB 5009. 4—2003;水分測定參考 GB 5009. 6—2003;


粗纖維測定參考 GB 5009. 10—2003;


總糖含量測定參考孫偉偉等的檢測方法。


1. 3. 2 高溫變性豆粕預處理


稱取粉碎過 80 目的高溫變性豆粕粉 5 g 到 500mL 三角瓶中,加入 250 mL 蒸餾水,在室溫下 ( 25℃ ) 振蕩搖勻 120 min。


1. 3. 3 聲波處理


將 1. 3. 2 處理好的高溫變性豆粕溶液放入聲波器中,分別處理15,30,45,60,75,90,105,120,135min,隨後立即放入冰水浴中冷卻至室溫,在 1 500 r / min下離心 10 min,取上清液用中速濾紙過濾後,測定其蛋白質含量。


1. 3. 4 高壓均質處理


將 1. 3. 2 處理好的溶液經過膠體磨兩次處理,準備均質處理。 調整均質機的均質壓力為 5,10,15,20,25 MPa,樣品分別經過 1 次和 2 次處理後,冷卻、離心等處理方式如 1. 3. 3。


1. 3. 5 微波處理


將1.3.2 處理好的溶液加入適量食用級消泡劑,放入微波爐中在輸出頻率 140,235,380,520,700 W 下加熱處理3 min,冷卻、離心等處理方式如1.3.3。


1. 3. 6 水浴加熱處理


將 1. 3. 2 處理好的溶液放入 25,40,55,70,85,100 ℃ 水浴中溫和攪拌加熱處理 120 min 後,冷卻、離心等處理方式如 1. 3. 3。


1. 3. 7 微波處理、水浴加熱處理的優化設計


以處理時間( min) 、pH、底物質量分數為影響因素,以可溶性蛋白質含量為檢測指標進行了L9( 34)正交優化設計。


1. 3. 8 微波處理蛋白質吸油性測定


樣品0.5 g 與大豆油3.5 mL 混勻,靜置30 min 後,5 000 g 離心 10 min,測定上清液中大豆油的體積。


吸油性( mL/g) = ( 起始大豆油體積 - 反應後大豆油體積) /樣品質量。


1. 3. 9 微波處理蛋白質乳化性測定


40 mL 0. 5% 的樣品溶液,加入 14 mL 大豆油,10 000 r·min- 1的條件下勻漿 1 min 後,立刻取 50μL,加入到 5 mL 的緩衝溶液中( 0. 1 mol /L pH 7. 0PBS) ,混勻,500 nm 下測其吸光值。


乳化性 = ( 2 ×2. 303 × A0× 稀釋倍數) /( 10 000 × × c) , ( 1)


式( 1) 中, 為 0. 25; A0為吸光值; c 為質量濃度( g/mL) 。


1. 3. 10 微波處理後蛋白質凝膠的製備及檢測


20% 溶液,均勻攪拌,脫氣 10 min,90 ℃ 條件下處理30 min 後,冷卻,置冰箱中過夜。 通過質構儀測定。


1. 3. 11 酶解高溫變性豆粕


1. 4 統計分析


利用 SPSS 13. 0 統計軟件進行數據分析檢驗。



2 結果與討論


2. 1 大豆高溫豆粕成分分析


大豆高溫豆粕中水分含量接近 10% ; 蛋白質含量高達 49%( 幹基) ,基本接近幹基物質總量的一半,含量較高,但氮溶解指數( NST) 僅為 21%。 眾所周知,這是大豆高溫豆粕加熱導致蛋白質高級結構發生改變的緣故,加熱造成蛋白質肽鏈鬆散,大量疏水基團外露,從而使蛋白質 NSI 下降。


2. 2 聲處理對高溫變性豆粕 NSI 的影響


在底物質量分數 2%,pH 7. 0 條件下,隨處理時間的延長,豆粕溶液的 NSI 值增長顯著,當處理時間達到 120 min 時,溶液 NSI 值增長到40. 69% ,隨後增長開始趨於平緩( 由 SPSS 的 Dun-can 式分析 120 min 和 135 min 的 NSI 值無顯著性差異) 。 這可能是聲波的瞬態空化效應,促使能量密度高度聚集,瞬間就會產生高壓、高溫等一係列極端物理效應,而使蛋白質結構產生崩潰,從而提高蛋白質的溶解性。


2. 3 高壓均質對高溫變性豆粕可溶性蛋白質影響


隨均質壓力的不斷提高,均質 1 次和2 次的高溫變性豆粕溶液的 NSI 值均不斷提高,達到 20 MPa 時達到,分別為 50. 34% 和 50. 70%,隨後開始下降。 均質造成的強剪切力是導致高溫變性豆粕 NSI 提高的原因,隨均質壓力進一步增大後,可能使已溶解的蛋白質再次發生結構的改變,疏水性基團暴露,使得 NSI 值下降。


2. 4 加熱處理條件對高溫變性豆粕 NSI 的影響


溫度對高溫變性豆粕溶液的 NSI 影響十分顯著,隨著溫度的升高,NSI 值增大,當溫度達到 100 ℃時,溶液的 NSI 值到達的 66. 56%。這與傳統理論認為蛋白質在受熱情況下變性,溶解性下降所不同。 但本研究的結果與一些研究者的結論是一致的,Arrese 等對大豆分離蛋白的 7S 和11S 蛋白質進行了 DSC 測定,結果發現 7S 和 11S 蛋白質的變性溫度分別是74 ℃和83 ℃。 Arrese 等、Petruccelli 等和 Wagner 等對加熱大豆分離蛋白的 NSI 進行了係統研究,發現 100 ℃下大豆分離蛋白仍然具有較高的溶解性。 高溫加熱處理,大豆分離蛋白 NSI 的提高是由於 7S 和 11S 之間的亞基通過二硫鍵重新結合,疏水性基團被包裹在中間,形成可溶性聚合物,因此加熱可以提高高溫變性豆粕溶液 NSI 值。


2. 5 微波處理對高溫變性豆粕可溶性蛋白質影響


在底物質量分數為 2%,pH 7. 0, 微波輸出功率對高溫變性豆粕溶液的NSI 值影響比較顯著,在 520 W、700 W 條件下溶液NSI 值明顯高於其他輸出功率下的 NSI 值,分別為49. 15% 和 51. 45% ,輸出功率在 700 W 條件下 NSI值與 520 W 相比較有顯著性差異。 由於微波輸出功率的不同造成水分子每秒鍾的震蕩次數不同,輸出功率升高,水分子震蕩更加激烈,使得溶液溫度不斷提高,水分子與豆粕的蛋白分子相互碰撞次數升高,從而使蛋白分子的結構造成的一定的變化,使其NSI 值升高。


2. 6 加熱處理條件對高溫變性豆粕的影響


2. 6. 1 底物質量分數對高溫變性豆粕 NSI 的影響


在 100 ℃沸水浴條件下,隨底物質量分數從 1% ~2%,高溫變性豆粕溶液的NSI 值基本沒有變化 ( 僅從 68. 81% 緩慢下降到68. 53% ) ,當底物質量分數繼續增高,NSI 值急劇下降。 這可能由於沸水浴向底物傳遞的熱量是一定的,當溶液濃度過大時,加熱所提供的熱量不足以使高溫變性豆粕全部的 7S 和 11S 蛋白質之間的亞基重新結合,形成可溶性聚集物,因此當底物濃度增高,相對於全部蛋白質的可溶性蛋白質,由於沒有形成足夠的可溶性聚合物,造成其 NSI 值下降。


2. 6. 2 時間對高溫變性豆粕可溶性蛋白質的影響


隨著時間增加,高溫變性豆粕溶液的 NSI 值逐漸增高。 統計分析表明: 時間達到60 min 時溶液 NSI 值為 67. 21% ,與更長時間的 NSI值無顯著性差異( 由 SPSS 的 Duncan 式分析 60 min後的 NSI 值無顯著性差異) ,因此認為從 60 min 後溶液 NSI 值趨於平緩。


2. 6. 3 pH 值對高溫變性豆粕可溶性蛋白質的影響


pH 值對熱處理高溫變性豆粕溶液的 NSI 值影響的趨勢明顯,隨溶液 pH 升高,溶液的 NSI 值不斷增加,當 pH 7. 0 時達到62. 63%,之後趨於平緩,這是由於在較高 pH 值下,被質子化的酸性及堿性氨基酸殘基基團失去了質子,使得蛋白質帶負電; 另外,pH 值會改變蛋白質的高級結構,不同結構下的氨基酸殘基不同,從而導致蛋白質溶解性的改變。


2. 6. 4 加熱處理高溫變性豆粕的條件優化


依據加熱處理高溫變性豆粕的單因素實驗結果,選取對提高 NSI 顯著的因素和水平,設計正交試驗。極差分析發現,pH 值對高溫變性豆粕溶液的NSI 值影響為顯著,其次為加熱時間和底物濃度。


優化方案為: A3B3C1,即 pH 8. 0,時間 90 min,底物質量分數 1%。經過驗證,在此條件下高溫變性豆粕溶液的NSI 值高達為 74. 81% 。


2. 7 不同微波處理條件對高溫變性豆粕 NSI 影響


2. 7. 1 微波處理時間對高溫變性豆粕 NSI 的影響


隨微波加熱處理時間的增長,高溫變性豆粕溶液的 NSI 值不斷增長,到達 4 min時為 69. 1%,隨後開始趨於平緩。


2. 7. 2 底物質量分數對高溫變性豆粕可溶性蛋白質的影響


隨底物濃度增加,高溫變性豆粕溶液 NSI 值不斷升高,當底物質量分數達到 4%時,NSI 值達到 70. 83% 為,隨即開始下降。 這與加熱處理有所不同,由於微波加熱的分子運動的高能量,使得溶液加熱更充分,但底物質量分數過高,可能使高溫變性豆粕蛋白受熱不充分,從而導致溶液 NSI 值下降。


2. 7. 3 pH 值對高溫變性豆粕可溶性蛋白質的影響


隨溶液 pH 值升高,高溫變性豆粕溶液 NSI 值先升高,pH 值達到 7. 0 時 NSI值為 71. 49 %,隨後趨於平緩。 這與加熱處理的 pH值影響趨勢基本相同。


2. 7. 4 微波加熱處理高溫變性豆粕的條件優化


根據微波處理高溫變性豆粕的單因素實驗結果,確定對 NSI 影響顯著的因素和水平,設計正交試驗。極差分析發現,以因素 pH 值對高溫變性豆粕溶液的 NSI 值影響為顯著,然後依次為時間和底物質量分數,優化方案為: A3B3C1,即 pH 8. 0,時間5min,底物質量分數 3% 。


通過驗證實驗證明,在此條件下高溫變性豆粕溶液的 NSI 值高達 70. 39%。


2. 8 吸油性的研究


大豆分離蛋白( SPI) 、未處理高溫變性豆粕( control) 、微波改性後的高溫變性豆粕( MWIT) 、酶解改性後的高溫變性豆粕( EMT) 吸油性差異比較結果比較。MWIT、EMT 以及 SPI、對照樣品吸油性差異性顯著。 與對照樣品相比,SPI的吸油性,MWIT 其次,EMT 低。 形成這種結果的原因可能是微波改性改變了蛋白質結構,使原本變性的蛋白質結構進行了重排,趨向於恢複 SPI的功能性,使疏水集團大量暴露,提高吸油性。 酶改性蛋白質分子量下降,親水基團數量上升而疏水基團數量下降,導致其親油性下降。


2. 9 pH 值對樣品乳化性的影響


隨 pH 值的升高,樣品的乳化性整體呈上升趨勢; 但在 pH 值為 4. 0 時,4 種樣品的乳化性均低。


SPI、control、MWIT 以及 EMT 的乳化性分別從 1. 58,1. 42,2. 87,1. 20 mL / g 上升到 26. 41,17. 29,27. 83,8. 47 mL / g。 由此可知,微波改性明顯提高了高溫變性豆粕的乳化性,顯著高於酶改性樣品。 這可能是微波處理後的蛋白質形成了聚合物,親水性氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基分布均勻,當遇到水和油時能夠更好地將親水基和疏水基在兩相界麵展開,pH 值升高有利於聚合物在油和水界麵的分布,並形成均一穩定的乳化液。 而酶改性蛋白質由於酶解過程,蛋白質分子量變小,大量疏水性氨基酸被酶解,在兩相界麵不能形象良好的伸展,致使其親油性下降。 而酶改性使得蛋白質分子質量親水性氨基酸殘基大量暴露而疏水性氨基酸殘基被大量破壞,使得乳化性明顯下降。


2. 10 樣品凝膠性的研究


SPI 和 MWIT 形成了較為結實的凝膠,凝膠強度過了 300 g,而且 MWIT 形成的凝膠強度和黏度都比 SPI 大; 樣品 control 和 EMT 未檢測到凝膠的形成,這可能是 control 樣品在加熱中的熱變性破壞了其三、四級結構,從而喪失了形成凝膠的能力。 由於微波處理形成的聚合物,以二硫鍵為主形成更為穩定的凝膠網狀結構,有利於水分的保持,產生更大的凝膠強度。


2. 11 加熱處理和微波處理對高溫變性豆粕 NSI影響的比較


微波處理靠電子輻射,造成分子震動,並使溶液溫度升高; 加熱處理靠熱傳遞對溶液升溫。 這兩種方式都是由於加熱使大豆球蛋白的 AB 亞基斷裂,與 β-半球蛋白的亞基發生結合,形成新的可溶性聚合物,使高溫變性豆粕的 NSI 值升高。 在相同底物質量分數( 3%) 下,微波處理後 NSI 值達到 70. 39%,但加熱處理後 NSI 值僅為 63. 96%。 從得到的結果分析,加熱處理和微波處理對提高高溫變性豆粕的 NSI 值都十分有效,尤其是微波處理的底物濃度更高,處理的時間更少,處理的效果更顯著,因此,微波處理技術應用在高溫變性豆粕溶解性改性方麵具有良好的工業化生產前景。


微波處理後的 NSI 值低於本課題組酶解處理後的 NSI 值,但微波改性後蛋白質的吸油性、乳化性和凝膠性均優於酶解處理後的。 這是由於蛋白質具備高級結構時才具備蛋白質的功能特性,微波處理使得蛋白質形成了可溶性聚合物,分子質量提高,而酶解使蛋白質分子質量減小,肽鏈斷裂,疏水性氨基酸殘基數量減少,更多的親水性氨基酸殘基暴露,溶解性上升,但蛋白質高級結構被破壞,功能性下降。



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